Tokyo Institute of Technology
Ohta-Shimojima Lab

研究の目的

私達の研究目的は、植物の脂質合成・代謝の分子機構やその機能、そしてそれらの進化の道筋を解明することです。
またその成果を最大限に活用し、植物や藻類で有用脂質の生産を行う仕組みづくりも目指しています。

脂質は生物を構成する重要な要素の一つであり、脂肪や油脂の形でエネルギーを貯蔵するだけでなく、生体膜構築、シグナル伝達、免疫応答など、生命が活動し続けるために必須な多くの機構において、中心的な役割を担っています。植物においても、脂質が重要な構成要素であることは変わりません。
植物に特徴的な例をあげると、植物の種子に保存されるトリアシルグリセロール(TAG)は、種を超えて広く保存された炭素保存の形態であり、発芽や発生に深く関与しています。他にも、光合成膜の主要構成膜脂質である糖脂質や、外界と植物体を隔てる表層脂質など、植物は多様な種類の脂質を含んでいます。
私達の研究室では、これらの植物が有する脂質に注目し、植物が外界の環境に適応するためにどのように脂質を変化させるのか、また、進化の過程で、脂質はどのように変化していったのかを解明することを目指しています。また当研究室ではそれらの知見を活用し、植物や藻類で有用脂質を高生産する仕組みを作ることも目指しています。

植物の脂質代謝・制御機構・機能の解析

植物には多様な形態の脂質が含まれており、様々な経路を通して、代謝・制御が行われています。 植物に含まれる各脂質の量やその脂肪酸組成は、葉や根など器官によっても異なりますが、外界から受けるストレス(温度、乾燥、栄養欠乏など)によって変化します。
その結果、植物はストレスに順応することが明らかになっていますが、その制御機構についてはわからない点が多く残されています。
当研究室では、ストレスに応答した脂質代謝の制御機構を分子レベルで明らかにすることを目標としています。

膜脂質転換

自然環境下において、植物はしばしばリン欠乏にさらされます。リンは植物が生育する上で必須の栄養素であり、これが欠乏すると、葉の老化・枯死や個体の成長抑制などが起こります。
そのため、農業生産において、リンの欠乏は非常に重大な問題であると言え、リン欠乏時に植物の中でどのような機構で応答が起こっているのかを解明することは、これらの問題を解決する手がかりとなり得ます。
当研究室では、そのような植物がもつリン欠乏応答機構の中でも、膜脂質転換に着目して研究を進めています。
リン欠乏下におかれた植物は、細胞膜内のリン脂質を分解して糖脂質で補い、細胞内にリン酸を供給します。この機構を膜脂質転換と呼び、植物の持つ主要なリン欠乏応答の一つであると考えられています。
私達は、この膜脂質転換を介した植物の環境ストレス応答の詳細を明らかにすることで、農業・産業への貢献を目指しています。


膜脂質転換

Fig.1 膜脂質転換の機構
植物は、リン欠乏状態において、生体膜を構成しているリン脂質を分解し、糖脂質に代替します。
この機構により植物は、リン脂質分解で生じたリンを、他のより重要な生体内の代謝系に転用しています。


糖脂質

生体膜の大部分がリン脂質で占められる動物に対し、植物葉では生体膜の概ね50%以上を糖脂質が占めており、主要な構成要素となっています。
これらの中でも、植物において主要な糖脂質はグリコグリセロ脂質であるモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)、ジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)、スルホキノボシルジアシルグリセロール(SQDG)であり、その他にグルクロノシルジアシルグリセロール(GlcADG)やトリ(またはテトラ)ガラクトシルジアシルグリセロール(TGDG, TeDG)などのグリコグリセロ脂質、スフィンゴ脂質、リポポリサッカライド、ステリル糖脂質などが含まれます。
これらの糖脂質は、生体膜を構成する役割以外にも、葉緑体の発達、リン欠乏への応答、凍結ストレスへの防御といった様々な役割を担っていることが知られています。
当研究室では、近年植物に広く存在することが分かったGlcADGや比較的蓄積量の少ないTGDGおよびTeDGについて解析を行い、植物がこれらの脂質をどのように利用しているのかについて調べています。

植物の生理活性物質

オキシリピン

オキシリピンとは、リノレン酸等の多価不飽和脂肪酸から合成される生理活性物質の一群で、植物の代表的なオキシリピンとしては、ジャスモン酸(JA)や12-オキソ-フィトジエン酸(OPDA)が挙げられます。
これらは、物理的外傷や、病原体・害虫に対する防御反応を引き起こすためのシグナル物資として機能しています。また、生長や花芽形成の制御にも関与していることが知られています。
藻類もアラキドン酸やエイコサペンタエン酸(EPA)等から、多様なオキシリピンを産生することが知られていますが、個々のオキシリピンが藻類においてどのような生理機能を持っているかについては、ほとんど知られていません。
当研究室では、植物・藻類のオキシリピンの合成・代謝経路に着目した研究を行っています。農業・医療の観点から見て、有用なオキシリピンを効率的に生産する手法の確立、また、その生合成経路を解明することを目的としています。

植物の進化と環境への適応

植物の陸上進出

地球の陸上生態系は、繁栄と大量絶滅を繰り返し、現在の豊かな生物多様性に至りましたが、その過程には、生産者である陸上植物の誕生と繁栄が大きく関わってきたと考えられます。
しかしながら、この生態系を支える陸上植物はどのようにして誕生したのかという事については未だ良く分かってはいません。
現在までの多くの研究により、淡水に生息する緑藻から分かれた車軸藻類が陸上植物の祖先となった事が明らかとなっています(図1、2)。さらに、この車軸藻類が様々な特性を段階的に獲得し、4億5千万年前にはすでに陸上植物が誕生していたと考えられています。
しかしながら、それまで比較的安定した環境である水中に生息していた植物が、乾燥や紫外線、激しい温度変化、重力など、過酷な陸上環境にどのようにして適応していったのか、未だ多くの部分が謎に包まれています。
そこで、私たちは植物が陸上環境に適応する機構をどのように発展させたのか明らかにするために、緑藻から陸上植物の祖先が誕生する過程において初期に分岐した車軸藻類のKlebsormidium nitens(以下クレブソルミディウム)のゲノム解析を行い、陸上植物に特有な遺伝子を多数獲得していることを明らかにしてきました(図2)(Hori.et.al, 2014)。
またクレブソルミディウムの他、陸上植物が誕生してから初期に分岐し、陸上植物の祖先の特徴を有していると考えられているコケ植物の一つであるゼニゴケを用いて、植物の陸上環境への適応機構の解明を進めています。
具体的には以下のような植物の陸上化に関わる環境応答機構の研究を進めており、どのように植物が陸上の過酷な環境に適応していったのかを解明することを目指しています。


陸上化

Fig.2 陸上の環境ストレス
藻類が陸上に進出するために、重力、強光、UV、乾燥、冠水、高温、低温、凍結等、厳しい陸上環境に対する耐性機構を獲得していき、陸上植物の環境適応機構が成立していったと考えられますが、その具体的な獲得過程は明らかではありません。


陸上化

Fig.3 緑藻から陸上植物に至る生物の系統関係
a) 最初の酸素発生型の光合成生物であるシアノバクテリアは約27億年前に出現したと考えられています。このシアノバクテリアが真核生物に細胞内共生して葉緑体となり真核藻類が誕生しました。
真核藻類は灰色藻、紅藻、緑藻に分岐し、緑藻から車軸藻類を経て陸上植物が誕生しました。
b) 緑藻から、陸上植物が出現する過程で様々な特性の獲得(喪失)と分岐を経て出現した生物群が車軸藻類です。(陸上植物の側系統群であり分類学的には適切な分類群ではないとする考え方もあります。)
クレブソルミディウムは車軸藻類の中でも比較的初期に分岐した藻類であり、主に湿潤な環境に幅広く生息する気生藻類(陸生藻類)です。


オーキシン応答機構の進化の解明

陸上植物は光や重力、栄養など様々な環境に応答して適切な形体をとれるよう成長を制御しています。この制御は主に植物成長調整物質(植物ホルモン)によって行われますが、その代表的なものの一つとしてオーキシンが知られています。
オーキシンは植物細胞の伸長を制御し、光や重力への屈性や、胚発生から器官分化に至るまで、植物の様々な成長に関与している重要な植物成長調整物質であり、陸上植物に共通してオーキシン応答メカニズムが保存されています。 しかしながら、植物がどのようにこのオーキシン応答メカニズムを獲得したのか明らかではありません。
私たちは、車軸藻類クレブソルミディウムの解析により、クレブソルミディウムは陸上植物に保存されている既知のオーキシン応答メカニズムを持っていませんが、細胞の分裂や伸張にオーキシンを用いている可能性がある事を示しました(図3)(Hori.et.al, 2014; Ohtaka. et. al, 2017)。
このクレブソルミディウムのオーキシン応答が陸上植物のオーキシン応答の起源となったのではないかと考え、この原始的なオーキシン応答機構の分子機構の解明を進めています。


陸上化

Fig.4 カルコフルホワイトで細胞壁を染色後、オーキシン処理を行い3日目の蛍光写真(細胞壁:青色、葉緑体の自家蛍光:赤色)
染色後に新生した細胞壁は染まっていないため、分裂を追跡する事ができます。(白矢印:染色後1回目の細胞分裂面、黄矢印:染色後2回目の細胞分裂面)
オーキシン未処理細胞では細胞壁の染色後、ほぼ2回の細胞分裂が起きていますが、オーキシン処理細胞では細胞分裂が抑制されている事がわかります. (Ohtaka. et. al, 2017 Fig. 5を改変)


乾燥応答誘導機構の進化の解明

陸上に進出した植物は、乾燥や凍結などの環境ストレスを認識し、ストレス情報を核に伝達することにより、保護タンパク質の発現や、活性酸素除去系の強化、細胞増殖の一時停止等の様々な機構を誘導することで細胞をストレスから保護し身を守っています。
この環境ストレス情報をを核に伝達する物質として、陸上植物ではアブシシン酸が広く用いられています。 私たちがクレブソルミディウムの乾燥ストレス応答を解析した結果、乾燥によってアブシシン酸を合成しますが、既知のアブシシン酸の受容体を持っておらず、アブシシン酸に応答しません。
しかしながら、陸上植物に非常によく似た乾燥応答を誘導する事を明らかにしました(図5)。この機構を明らかにする事で、植物が環境ストレス応答機構をどのように発達させていったのか重要な知見が得られると考え、解析を進めています。


GC

Fig.5 転写応答解析から予測されたクレブソルミディウムの乾燥応答
乾燥状態が進むと脱水によるタンパク質の障害や浸透圧の異常により光合成能が低下します。 その結果、過剰となった光エネルギーにより活性酸素が発生し、さらに細胞障害を引き起こします。クレブソルミディウムは陸上植物に似た乾燥応答機構を獲得しており、乾燥による障害から身を守ります。


膜脂質代謝による環境適応機構の解析

生体膜は細胞の基本的な構成要素であり、環境が変化しても常に正常に機能しなくてはなりません。移動することができない陸上植物は環境変化に対して生体膜の機能を維持する様々な機構を高度に発達させてきました。
私たちは陸上植物に特有と考えられていた2つの生体膜維持機構がクレブソルミディウムが分岐する前に獲得していたことを見出しました。
その一つはオリゴ糖脂質合成による葉緑体膜の保護機構です。凍結や乾燥などにより細胞が脱水状態に陥ると様々な障害が引き起こされますが、葉緑体膜と他の生体膜の融合により生体膜が破壊される事がその要因の一つです。陸上植物は葉緑体のダメージを感知し、大きな極性頭部を持つトリガラクトシルジアシルグリセロール(TGDG)を葉緑体膜に蓄積することで、葉緑体膜と他の膜の融合を防いでいると考えられています(図6)。
もう一つは、酸性糖脂質グルクロン酸ジアシルグリセロール(GlcADG)の蓄積によるリン欠乏環境への適応機構です。リンは主要な生体構成成分として生命活動に必須の元素であり植物の3大栄養素の一つです。しかしリンは不足しがちな栄養素であり、しばしば欠乏状態に陥ります。そうすると生体膜においてはリン脂質の合成に支障をきたし、正常な生体膜を維持できなくなってしまいます。そこで植物はリン脂質の一部を特性の似た他の脂質によって置き換え、リンを節約する膜脂質転換機構を高度に発達させています(図7)。どのリン脂質を、どの脂質によって置き換えるかは生物によって異なる点もありますが、栄養素を求めて移動する事ができない植物では陸上植物では高度に膜脂質転換機構が発展しています。その1つとして酸性糖脂質GlcADGの合成が、リン欠乏耐性に重要な役割を果たす事が示されています(Okazaki et al.,2013)。
これらの膜脂質代謝による生体膜維持機構の特性をクレブソルミディウムやゼニゴケを用いて明らかにし、植物の環境適応と進化においてどのような働きをしたか研究を進めています。


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Fig.6 脱水状態における葉緑体膜の保護機構
a) 乾燥や凍結によって細胞が脱水状態におちいると、植物は極性頭部の大きなTGDGを葉緑体膜に生産し、膜の融合が起きないようにしています。
b) このTGDGの合成酵素が働かない変異株では、脱水状態によって葉緑体膜が他の膜と融合し、生体膜が破壊されるため、脱水状態に極めて弱くなってしまいます。


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Fig.7 膜脂質転換によるリン欠乏環境への適応機構
リン欠乏環境では、リン脂質の分解により生じたリン酸は他のリン酸が必要とされる場所に供給されると同時に、性質の似た糖脂質やベタイン脂質が合成されリン脂質の代わりに膜の機能を維持します。


表層脂質の進化過程の解明

表層脂質は、陸上植物が環境ストレスに適応するための機構の一つとして知られています。種子植物の表層脂質はクチンとワックスから構成され、外部環境と細胞を隔てる疎水性のバリアとして機能しています。
表層脂質は、病害虫や紫外線からの保護だけでなく、気孔以外の場所からの水の蒸発を防ぎ、乾燥耐性にも寄与していると考えられています(図8)。
私たちは車軸藻類のクレブソルミディウムでは、種子植物の固体状のワックスと異なり、液性の中性脂質からなるワックスバリアを発達させている事を示しました(Kondo et al., 2016)。このことから、植物の表層脂質は車軸藻類から種子植物への進化過程において、その構造を大きく変化させていったと考えています。
そこで、私たちは、車軸藻類と種子植物の間を繋ぐ植物種としてゼニゴケの表層脂質を解析し、植物の進化の過程で表層脂質がどのように変化していったのか解明を進めています。


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Fig.8 植物の表層構造
植物の表層は、クチンと呼ばれる脂質ポリマーやワックス、多糖類におおわれており、クチクラ層と結晶状のクチクラ外ワックスを形成します。この表層により強光や病害菌など外界のストレスから身を守るとともに、細胞内の水の蒸発を防止し乾燥を防いでいます。


主な解析手法

脂質解析

当研究室では、ガスクロマトグラフィー(以下GC)を用いて、植物の脂質全般の解析を行っています。GCは、多数の化合物が混合された試料を気化させ、各化合物ごとに分離、定量、解析することのできる測定装置です。
試料をGCの解析にかけると、試料気化室で加熱されて気化し、キャリアガスと一緒に流されてカラムに送られます。気化した試料はこのカラムを通り、流れる速度に応じて分離された後、検出器によって検出されます。
植物に含まれる脂質や、他の化合物の解析を詳細に行う上で、GCやLC/MSといったクロマトグラフィー質量分析手法は必要不可欠な技術です。
脂質を研究する上で欠かせないのが脂質を正しく測定する技術です。脂質の測定は主に薄層クロマトグラフィー(TLC)による脂質種の分離とガスクロマトグラフィー(GC)による脂肪酸の同定・定量の組み合わせにより行われます。


GC

Fig.9 GCによる脂質分析手法の概説
植物に含まれる脂質をGCで解析するための手順は上記の通りです。
まず、植物の総脂質を抽出し、TLCプレートにスポッティングします。その後、二次元展開を行い、脂質を分離します。二次元展開が終わったTLCプレートを、プリムリン法やアンスロン法に よって染色し、スポット毎に脂質を回収します。さらに、メタノリシス、液液抽出を行ってサンプルを調製し、GCによる測定を行います。


しかしながら、近年は今まで研究に使われてこなかった新しい植物を用いることが増え、TLCやGCによる脂質種・脂肪酸種の同定が困難なことがあります。このような場合には液体クロマトグラフー質量分析計(LC/MS/MS)やガスクロマトグラフー質量分析計(GC/MS)を用いた同定作業を行います。
脂質の測定については、ハイスループットであることを特徴としたLC/MS/MSによる脂質の網羅的定量系(リピドミクス)の実施例が増えています。当研究室においてもハイスループットに加え、①夾雑物の影響を最小限にし、②各分子種それぞれの濃度を質量ベースで定量可能であるリピドミクスの系の構築に意欲的に取り組んでいます。


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